EndoFree Plasmid Maxi Kit
Hoc ornamentum aptum ad extrahendam ex 150 – 300 ml solutionis bacterial exculta pernoctare, emendato SDS-alkaline lysis methodo ad lysin bacteria adhibita.Crudum extractum selective coniungitur cum unica Endotoxin Scavenger et per centrifugationem ad endotoxinos removendos separatus.Tum, membrana gel silica selective ligat plasmidum DNA in solutione sub condicionibus summi salis et humilis pH.Hoc sequitur additamentum ablutionis quiddam ad removendum impuri- ties et alia bacteria composita.Denique quiddam sal humile, alte pH elutionis, ad purum plasmidum DNA eluendum e membrana matricis pii adhibetur.Silica gel membrana peculiari adsorptione membranae utitur, et adsorptio quantitatis differentiae inter columnam et columnam valde parva est et repetitio bona est.Phenol, chloroformia et aliae reagentia toxici non requiruntur, neque gradus praecipitationis ethanol sunt.Hoc ornamentum adhiberi potest ad celeriter extrahendum 0.2 -1.5 mg e plasmidis DNA purae summae exemplar, cum rate extractionis 80% -90%.Ornamentum singulari processu utitur formula endotoxin tollit, contentum endotoxin valde humile est et cellula transfectio effectus excellens est.Plasmidus extractus directe adhiberi potest in digestione enzyme, PCR, in vitro transcriptione, transformatione, sequence et aliis experimentis biologiae hypotheticis.
Repono conditionibus
RNaseA recondi debet ad -30~-15℃ et transferri ad ≤0℃.
Endotoxinus Scavenger condi potest in 2~8° per unum mensem, conditum ad -30~-15℃ per longum tempus repositionis.et transportavit ad ≤0℃.
Aliae partes debent in cella temperiei reponenda (15 ~25℃) et in cella temperiei transportari.
Components
| Components | 10RXNS |
| RNAse A | 750 μL |
| Quiddam P1 | 75 ml |
| Quiddam P2 | 75 ml |
| Quiddam P4 | 75 ml |
| Endotoxin Scavenger | 25 ml |
| quiddam PW* | 2 22 ml |
| Quiddam TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi Columns (Quilibet in 50ml Collection Tube) | 10 |
| Endotoxin-liber collectionis Tube | 2 5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNA removebat.
quiddam P1;bacterial quiddam suspensionis, RNaseA ad Buffer P1 ante primum usum adde.
Quiddam P2:bacterial lysis quiddam (continens SDS/NaOH).
Quiddam P4:quiddam curat.
Endotoxin Scavenger:endotoxin ex crudo plasmido extractum efficaciter removere.
Quiddam PW:Lava quiddam, stipulatum volumen ethanol praevie usum adde.
Quiddam TB:quiddam elution.
FastPure DNA Maxi Columnae:plasmid DNA adsorption columns.
Collectio Tubuli 50 ml:collectione filtrate tube.
Endotoxin-liber collectionis Tube:collectione plasmid DNA tube.
Paravit Materias
Ethanolum absolutum, isopropanolum, 50 ml tubi centrifugii rotundi undi et 50 ml endotoxin- liberummachinae fistulae.
Applications
Productum hoc est idoneum ad extractionem plasmidarum magnarum ab 150 - 300 ml solutionis bacterialexcultus cod.
Experimentum Processus
1. Accipe 150 - 200 ml (non plus quam 300 ml) solutionis bacterial exculta pernoctare et centrifugium atcirca 11.000 rpm (12,000 × g) pro 1 – 2 min.Relinquere supernatant et bacteria collecta.
Cum plus quam 50 ml solutionis bacterial colligendis, bacteria colligi potest addendo solutionem bacterial, centrifugationem, abiecta supernatantem et alios gradus in eodem tubo 50 ml.
multipliciter.
2. 7.5 ml Buffer P1 addere (reprehendo quaeso num RNaseA additum sit Buffer P1) ad fabricam fabricamtubus bacteria continens et permisceto vortice vel pipetting.
Tota resuspensio bacteria in hoc gradu critica est cedere, et post resuspensionem filicum bacteriales non esse debent.Si filicum bacteriales non permiscentur, lysis, ex humili cede et puritate, afficiet.Si OD600 solutionis bacterialis est 0.65, commendatur ut 7.5 ml Buffer P1 adhibeatur cum ex 150 ml solutionis bacterial extrahendis;cum OD600 sit 0.75, 8 ml Buffer P1 utendum sit, et codices Buffers P2 et P4 mutentur.Si volumen solutionis bacterial auctus ad 200 ml, commendatus estvolumen Buffers P1, P2, et P4 proportionaliter augeatur.
3. Adde 7.5 ml Buffer P2 ad bacterial suspensionem a gradu 2 ac leniter sursum ac deorsum pro 6 - 8 miscere.tempora et incubare ad locus temperatus pro 4 – 5 min.
Δ Inverte leniter permisceto.Vortexing ruptionem genomicam DNA efficiet, quae in fragmentis genomicis DNA in plasmido extracto efficiet.Hoc tempore solutio viscosa et translucens fit, ostendens bacteria plene inquinatum esse.Duratio non excedit 5 min ad vitandum plasmidarum interitum.Si solutio non est manifesta, possunt etiam plures bacteria ex eo evenireincompleta lysis, ita convenienter bacteria redigenda est.
4. Adde 7.5 ml Buffer P4 ad suspensionem bacterial a gradu 3 et statim invertunt leniter 6 - 8 tempora, ut solutionem omnino corrumpant Buffer P2.Hoc tempore albae flocculentae praecipitatae apparere debent.Centrifugium plus quam circiter 11.000 rpm (12,000 × g) pro 10 – 15 min, diligenter pippette supernatantem in novum 50 ml tubum centrifugii rotundi fundum (se praeparatum) et devita.aspirare fluitantem album praecipitem.
Δ Buffer P4 addere et statim invertere bene miscere.Relinquere fistulam ad standum usque dum praecipitatio alba aequaliter per solutionem distribuitur, ne productio loci praecipitationis quae neutralization afficere possit.Si ante centrifugationem praecipitatur flocculentus albus uniformis et supernatans post centrifugationem non liquet, tubus potest esse.centrifuged pro alio 5 min.
5. Adde 0. 1 temporum volumen (10% voluminis supernatantis circa 2.2 ml) de Endotoxin Scavenger ad supernatantem a gradu 4 et inverti ad miscendum.Solutio in balneum glaciei pone vel inserendum in glaciem contritam (vel leo freezer) pro 5 min usque ad solutionem mutationum a turbido ad purum et perlucidum (vel adhucleviter turbidus), et aliquoties interdum miscere.
Post Endotoxin Scavenger supernatante additur, supernatans turbidus fiet;supernatant ut in glacie balnei refrigerati vel leviter turbidi clarescat.
6. Post supernatantem ponatur in locus temperatus (>25℃) pro 10-15 min, turbida fiet aseius temperatura ad cella temperies auget.Tum superna- tant miscere inverti.
Si locus temperatus inferior est vel tempus extractionis minuere vis, supernatans incubari potest in aqua 37~ 42℃ balnei aquae pro 5 – 10 min et proximus gradus peragi potest post supernatantem.turbida fit.
7. Centrifugium supernatantem circiter 11.000 rpm (12,000 × g) pro 10 min in cella temperie (temperatus >25℃) ad tempus separandum.Pars superior aquei DNA continet dum iacuit oleum oleum inferius caeruleum continet endotoxin et alia immunditia.TransferreDNA continens tempus aqueum ad novam fistulam etoleum iacuit abiicias.
Temperatura in centrifugatione debet esse super 25℃, sicut periodus efficax separatio non facitsi siccus est humilis.
Si Phase separatio efficax non est, temperies centrifugationis ad 30℃ et accommodari potesttempus centrifugationis ad 15 min.
Caeruleum stratum oleum cum endotoxino aliisque inquinamentis non suges ne.
Mechanismus
Lysis Resuspensio Neutralisation
◇ Adde 7.5 ml Buffer P1
◇ Adde 7.5 ml Buffer P2
Adde 7.5 ml Buffer P4
Endotoxin remotionem
◇Adde 0. 1 temporum supernatantem volumen Endotoxin Scavenger .
Alligatio et lavatio
◇ Adde 0.5 temporibus volumen isopropanol
◇ Add 10 ml Buffer PW
◇ Add 10 ml Buffer PW
Elution
Adde 1 – 2 ml Buffer TB vel Endotoxin libero ddH2O
